新的研究为寻求更好的疼痛治疗的药物设计师提

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  新的研究为寻求更好的疼痛治疗的药物设计师提供了新的见解

  2013年12月5日

  加州大学旧金山分校的创新打破了分辨率的障

  在技​​术巡回演出中,加州大学旧金山分校(UCSF)的科学家们已经以接近原子的分辨率确定了一种蛋白质的结构,该蛋白质在疼痛和热量的感知中起着重要作用。

  在加州大学旧金山分校的博士后研究员Erhu Cao博士和Maofu Liao博士的带领下,这项新研究将为寻求新的和更好的疼痛治疗的药物设计师提供新的见解,但它也是结构生物学领域的一个分水岭,旨在了解蛋白质的物理构造方式,以便更好地了解它们的功能。

  到目前为止,新研究中使用的方法,即电子冷冻显微镜或冷冻EM,被认为无法以如此细致的方式可视化小蛋白质。

  “影响将是广泛的”,电子显微镜专家Yifan Cheng博士,加州大学旧金山分校生物化学与生物物理学副教授,两篇论文的共同资深作者,报告了该蛋白质的结构,称为TRPV1(发音为“trip-vee-one”),分辨率为3.4埃。 (相比之下,一张纸大约有100万埃。)“过去,人们从不相信你能用这种方法来获得这种分辨率 - 这被认为是不可能的。这开辟了很多机会。“

  研究结果发表在2013年12月5日的“自然”杂志上。

  TRPV1具有独特的性质,自1997年由加州大学旧金山分校生理学系教授兼主席David Julius博士首次发现以及新的低温EM论文的共同高级作者以来,一直引起了生物学家和公众的兴趣。

  在感觉神经细胞中大量存在,TRPV1是一个离子通道:它在细胞膜上形成一个孔,钙等离子可以通过这个孔,改变细胞产生动作电位的倾向,并将信号传递给其他神经元。

  但与其他离子通道不同,TRPV1可响应化学物质或温度变化。例如,TRPV1将改变其形状,以在辣椒素存在的情况下打开其通道,辣椒素是一种辛辣的化合物,可以为辣椒提供火热的刺激,同时也可以响应足够高的温度来引发疼痛。

  朱利叶斯及其同事已经证明,一系列引起疼痛的毒素和炎症化合物来源于蜘蛛毒素和植物等多种来源,也会激活TRPV1,这使得蛋白质成为药物开发者关注的焦点。

  Nature中两篇新论文中的第一篇论文描述了TRPV1处于静止状态的结构,而第二篇展示了TRPV1通道在与蜘蛛毒素和辣椒素样化合物结合时如何改变形状。可视化支持“双门”。 TRPV1活化的模型,其中通道的不同部分可响应不同的化学试剂改变构象,这些信息对于希望通过精确控制TRPV1门控来调节疼痛反应的药物设计者是有价值的。

  “这有点像看到通道的快照关闭,然后部分打开,然后完全打开,这对于离子通道非常罕见”。朱利叶斯说。

  在新的Nature论文之前,Cheng说,“TRPV1和类似蛋白质结构的最佳分辨率大约是15到20埃,并且许多来自低分辨率数据的结构缺乏足够的细节来提供机械信息。”根据Julius的说法,许多结构生物学家认为冷冻EM本质上不如X射线晶体学,在最好的情况下可以达到小于2埃的分辨率,有些人认为冷冻EM是“blob-ology”。 ;

  但正如其名称所暗示的那样,X射线晶体学需要结晶感兴趣的蛋白质,这对于嵌入细胞膜的TRPV1等蛋白质来说极难实现。这种被称为完整膜蛋白的蛋白质是生物学重要领域的重要参与者,包括细胞信号传导和药物作用。

  从大约四年前开始,Julius实验室的博士后人员Cao在两篇新论文中与Liao分享了第一作者,他开始创建TRPV1的高度稳定,功能性副本,他希望在X射线晶体学研究中使用它,但是蛋白质固执地抵抗结晶。

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  “我们想知道,”朱利叶斯说,“在没有晶体的情况下,是否有另一种方法可以从这种表现良好且功能正常的蛋白质中获取结构信息?”

  在走廊的相遇中,朱利叶斯得知加州大学旧金山分校生物化学与生物物理学教授,大卫阿加德博士和霍华德休斯医学研究所(HHMI)研究员在cryo-EM方面取得了重大技术进步,并鼓励曹先生合作与郑氏实验室的博士后研究员廖先生一起研究TRPV1的低温EM研究。

  在cryo-EM中,通过将许多拷贝的蛋白质(称为单个颗粒)置于水溶液中来产生样品。将样品投入液体乙烷中,以每秒100,000摄氏度的速率冷却溶液,将颗粒悬浮在零下172摄氏度的无数角度的保护性玻璃冰中。

  然后使用电子显微镜对样品进行成像,研究人员将粒子图像输入功能强大的计算机,这些计算机将来自多个二维视图的信息组合在一起,以计算物体的三维结构。

  在HHMI的支持下,Agard及其同事设计了一种用于低温EM的新型摄像机,它可以直接捕获电子,而不是像以前的摄像机那样首先将电子转换为光。

   同时,利用新相机每秒400帧的速度,Cheng和Agard实验室的博士后助理薛学明设计了一种运动校正算法,进一步提高了分辨率。去年5月在Nature Methods中报道的硬件和软件的组合创新导致分辨率比传统的低温EM大大提高。

  “图片就像一部电影,你可以补偿样本的微小移动,”郑说。 “现在我们可以以3埃的分辨率记录样品的每个单个图像。”

  使用这些新的低温-EM技术,显着提高了分辨率,Cao和Liao在几个月内将TRPV1可视化为3.4埃,这是整体膜蛋白的单粒子低温EM的前所未有的成就。

  现在他们已经成功地将TRPV1可视化与其某些化学合作伙伴结合,该团队希望通过首先加热样品然后快速冷却以进行扫描来确定蛋白质在受热时如何改变形状。

  朱利叶斯说,准确捕捉蛋白质形状变化的能力是cryo-EM的强大优势之一,他预计许多结构生物学家,甚至那些喜欢X射线晶体学的人,都会在他们的工具包中加入cryo-EM,谢谢在Cheng和Agard的UCSF实验室取得的进展。

  “这些论文报道了TRPV1的结构,但它们也展示了cryo-EM作为结构测定方法的实用性,并且它也可能是用于观察多种构象的蛋白质的非常有效的技术,”他说。

  朱利叶斯说,尽管研究小组使用新方法来确定TRPV1的结构,但他对蛋白质生物化学方面的长期认识使他对其准确性有了极大的信心。

  尽管在对蛋白质进行了超过15年的研究后,他几乎可以在他的脑海中想象出TRPV1,他说有一些“原始”的东西。关于在计算机显示器上排列的单个TRPV1颗粒的图像。

  “当你看到TRPV1的结构,并且你知道它很适合这些数据时,你会看到一种内心的,情绪化的反应,你会想,现在我们真的知道这件事是什么样的。 "

  程同意了。 “眼见为实”,他说。

  资料来源:加州大学旧金山分校